UNIDAD DE ANALISIS DE ADN

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COMO SE EFECTUAN LOS ESTUDIOS DE PATERNIDAD / FILIACION POR ANALISIS DE ADN?

Extracción del ADN:

La muestra biológica (sangre, uñas, hisopados o cualquier otro tejido que contenga células humanas con núcleo) se somete a la acción de detergentes, que disuelven los lípidos; y enzimas proteolíticas, que cortan las proteínas.

Luego de incubar la mezcla una noche a 60 grados centígrados, se produce la ruptura de la estructura celular liberando todo su contenido a la solución.

La mezcla se limpia mediante sucesivos lavados con solventes orgánicos (fenol, cloroformo), que coagulan proteínas y extraen los lípidos, y finalmente el ADN se separa por precipitación con alcohol en medio salino.

Eventualmente, en los casos de manchas antiguas o huesos, se realizan purificaciones posteriores por diálisis o adsorción a soportes sólidos.

Existen métodos alternativos en los cuales la muestra sanguínea se deposita sobre un papel especial, que la mantiene inalterada por años a temperatura ambiente. Previo al análisis, se cortan con un sacabocados pequeños fragmentos del papel (alrededor de 1 mm) y se extraen las impurezas mediante lavados. El papel así procesado, con el ADN adherido, se analiza directamente colocándolo en la mezcla de amplificación.

Análisis del ADN extraído:

Se realiza mediante PCR o reacción en cadena de la polimerasa, que es un proceso que consiste en imitar una actividad normal que efectúan las células para su reproducción: la copia del ADN, aunque en este caso limitado a pequeños fragmentos, en los cuales están ubicadas las regiones variables.

Para ello, se coloca en cada tubo una porción del ADN extraído de cada persona y una mezcla que contiene nucleótidos, sales, una enzima que "copia" ADN (denominada polimerasa) y los "primers" que reconocen la zona variable.

La mezcla se somete a variaciones de temperatura en un ciclador térmico, que produce sucesivamente tres temperaturas diferentes: una que desnaturaliza o separa las cadenas del ADN, otra que facilita que los "primers" reconozcan y se adhieran a la región a copiar, y la tercera que permite la extensión de la cadena copiada, mediante la unión de los nucleótidos que se encuentran en la solución, con la ayuda de la polimerasa.

Luego, los amplificados se someten a un campo eléctrico en el interior de un soporte semisólido o gel (electroforesis). Como el ADN está cargado negativamente, se dirige hacia el polo positivo, los fragmentos pequeños más rápido que los grandes, produciendo su separación.

Finalmente, los fragmentos separados se visualizan mediante sistemas automatizados de última generación, en los cuales al proceso de electroforesis lo efectúa un secuenciador automático, que lee mediante un rayo laser los "primers", marcados con un fluorocromo, adheridos a las zonas variables. Una computadora permite determinar qué variantes son las que se encuentran en cada muestra.

Los resultados se visualizan como "picos" en un gráfico, cuya interpretación es la siguiente:

1- En estudios de paternidad y/o maternidad:

Considerando que cada individuo hereda una variante de su madre y la otra de su padre biológico, supongamos los siguientes resultados para un hipotético "sistema A":

Es evidente que el hijo comparte una variante con su madre y la otra con su padre alegado, por lo cual podría ser hijo de ambos. Sin embargo, esa situación puede darse por azar, ya que hay muchos individuos de la población general que presentan esa variante compartida.

Entonces, repetimos el estudio con otro sistema, que analizará una zona variable diferente. El resultado para ese "sistema B" podría ser:

y se confirmaría la inclusión. Para que el estudio resulte suficientemente creíble, se acepta a nivel mundial que deben analizarse un mínimo de 12 sistemas de microsatélites, por supuesto, con inclusión en todos los casos. Para las técnicas actuales automatizadas, ello no presenta ningún inconveniente, ya que existen métodos de amplificación de 15 regiones variables en una sola reacción.

El estudio completo, con sistemas de última generación, como los empleados en la Unidad de Análisis de ADN del Colegio Oficial de Farmacéuticos y Bioquímicos, se vería así:

En el ejemplo anterior, se observan 15 sistemas variables y además el denominado "amelogenina", que sirve para determinación de sexo: en lo varones se aprecian dos picos ("XY") y en las mujeres, sólo uno ("XX").

Otra posibilidad para el sistema B sería:

que indicaría la exclusión del padre alegado como padre biológico. Para asegurarse que no se deba a una falsa exclusión debida a una mutación, se sugiere continuar el estudio hasta observar al menos tres situaciones como ésta (de no compartición de variantes entre padre e hijo alegado).

Las variantes mencionadas se codifican por convención mediante un número (ubicado en el esquema en la parte inferior de cada pico), que expresa el número de veces que está repetida la secuencia que caracteriza al sistema. Así, en nuestro hipotético "sistema A", los resultados se expresarían como:

Madre: 8-12.

Hijo: 8-13.

Padre alegado: 12-13.

Cualquier otro estudio, realizado en cualquier lugar del mundo, del mismo "sistema A", debe necesariamente arrojar los mismos resultados numéricos. Si eso no ocurre, alguno cometió un error.

Finalmente, se realiza un cálculo estadístico de la probabilidad de paternidad e índice de paternidad, basándose en análisis efectuados previamente de las variantes observadas en individuos no relacionados de la población general. Cuanto menos frecuentes en la población sean las variantes obtenidas, mayores serán la probabilidad y el índice de paternidad.

Habitualmente, para individuos vivos, la "probabilidad de paternidad" es superior al 99,99%. Por ejemplo, un "índice de paternidad" de 1,2 x 10⁶ indica que 1 de cada 1200000 individuos de la población general podrían ser asignados como padres biológicos del hijo en cuestión, sin serlo, es decir, por azar.

2- En estudios de identidad entre evidencias y sospechosos:

En estos casos la interpretación es mucho más sencilla, ya que todos los sistemas deben coincidir exactamente para que dos muestras biológicas correspondan al mismo individuo.

Por ejemplo, si se estudia una colilla de cigarrillo, el resultado debe coincidir totalmente con el material sanguíneo indubitado del sospechoso para concluír que pertenece a él.

Si se analiza un hisopado o una prenda de una mujer que ha sufrido una violación, el patrón genético obtenido debe ser idéntico al de la muestra sanguínea del sospechoso, o a una mezcla víctima-sospechoso, para suponer la participación del imputado en el hecho.

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